詳解制作防護(hù)蠟切片步驟

防護(hù)蠟切片組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法。防護(hù)蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。防護(hù)蠟切片詳細(xì)操作步驟：

1、取材

2、固定

3、脫水：30%--50%---70%（每步60分鐘）---85%---95%--100%---100%（每步30分鐘）。

4、透明：轉(zhuǎn)入1/2二甲苯＋1/2無水酒精混合液20ml透明1h，純二甲苯20ml透明1h，再用純二甲苯20ml透明40min，并回收各液。

5、浸蠟：（1）將材料分別放入25%、50%、75%的防護(hù)蠟-二甲苯溶液中，每級(jí)30分鐘。該過程在高于防護(hù)蠟熔點(diǎn)3℃的溫箱中進(jìn)行；（2）將材料放入溶解的純蠟中，時(shí)間為30分鐘，該過程再重復(fù)兩次。在高于防護(hù)蠟熔點(diǎn)3℃的溫箱中進(jìn)行。

6、包埋（1）將溶解好的防護(hù)蠟在加入預(yù)先折好的紙船中，防護(hù)蠟溶解后應(yīng)過濾后使用，以免含雜質(zhì)影響切片；（2）材料放入紙船，并擺好在蠟中的位置，如果包埋的組織塊較多，應(yīng)進(jìn)行編號(hào)；（3）將紙船放置在冷水上加速冷卻過程。

7、切片（1）修整：用刀片修成方形或長(zhǎng)方形蠟塊；（2）以少許熱蠟液，將蠟塊底部粘附于小木塊上，以少許防護(hù)蠟融化在蠟塊邊緣，加強(qiáng)粘附的強(qiáng)度；（3）木塊粘附于切片機(jī)上，調(diào)整切片機(jī)，使蠟塊切面與切片刀刃平行；（4）切成連續(xù)的蠟帶，切片刀的銳利度、蠟塊的硬度都會(huì)影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水適當(dāng)改變防護(hù)蠟的硬度，也可在冰箱中放置一段時(shí)間；（5）分割蠟帶，分開的蠟片放在45℃溫水上，使蠟片展開。

8、粘片與烤片（1）可用粘片劑防止蠟片滑脫，但粘附劑通常容易被染色而使切片背景有顏色，影響觀察，實(shí)驗(yàn)表明，載玻片洗的足夠干凈，一般不會(huì)滑片；（2）用載玻片撈取展開后的蠟片，調(diào)整蠟片的位置使位于載玻片中央，自然干燥。

9、脫蠟與醇化（1）將切片放入純二甲苯溶液中10分鐘，使防護(hù)蠟完全溶解，共2次；（2）溶去防護(hù)蠟的切片依次放入75%、50%、25%二甲苯-乙醇溶液中，每級(jí)10分鐘；（3）再將切片依次放入100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%的乙醇溶液中進(jìn)行醇化，每級(jí)10分鐘。

10、染色（1）將切片放入番紅染液中30分鐘，番紅染色后，將切片依次放入50%、60%、70%、80%的乙醇溶液中分級(jí)洗脫，每級(jí)10分鐘；（2）洗脫后的切片放入固綠染液中染色1分鐘；

11、脫水、透明與封片（1）染色后的切片依次放入90%、90%、95%、100%乙醇溶液中分級(jí)洗脫，每級(jí)10分鐘；（2）洗脫后的切片依次放入25%、50%、75%、100%、100%二甲苯溶液中透明，每級(jí)10分鐘，出現(xiàn)渾濁表示脫水不徹底，需重來；（3）滴1-2滴中性樹膠，將潔凈的蓋玻片傾斜放下，封片，鏡檢，選擇好的貼上標(biāo)簽，永久性切片制作完成。